Aprovechando el esqueleto de un viroide

Todos hemos oído hablar alguna vez de los virus: el virus de la hepatitis, el del sarampión, el de la gripe… ejemplos que afectan al ser humano; pero también existen virus que afectan a las plantas y las bacterias. Los virus están constituidos por partículas proteicas que encapsulan su material hereditario (que puede ser de ADN o ARN) y para replicarse necesitan obligatoriamente infectar una célula viva.

Pero, si pensabais que los virus eran la entidad infecciosa más pequeña que existía, estabais equivocados. Allá por los años 70, Theodor Diener demostró que aquello que causaba la enfermedad del tubérculo fusiforme de la patata era una pequeña molécula de ARN circular que no presentaba ninguna cápsula proteica. Éste fue el primer viroide identificado. Ahora bien, estos agentes infecciosos solo afectan a plantas. Los viroides son capaces de “confundir” a la célula infectada de manera que ésta empiece a realizar copias del material genético de éstos. Una de las propiedades destacables de los viroides es que, a pesar de tratarse de moléculas de ARN de cadena sencilla, presentan una gran estabilidad intracelular dado que se trata de una forma circular altamente estructurada.

Pues bien, el trabajo de final de máster que estoy realizando en el laboratorio de José Antonio Daròs en el IBMCP (CSIC-UPV, Valencia) se enmarca dentro de un desarrollo biotecnológico que trata de utilizar al viroide latente de la berenjena (ELVd, por sus siglas en inglés, Eggplant latent viroid) como herramienta para producir ARNs de nuestro interés. Dicho con otras palabras, lo que queremos es añadirle al viroide un trozo de ARN de particular interés para que se produzca junto a éste.

En estudios previos se había conseguido exitosamente la producción del ARN Spinach por este sistema. Este ARN tiene la peculiaridad de emitir fluorescencia verde cuando se une a una determinada molécula orgánica, de forma que podemos visualizarla utilizando un microscopio especial.

En esta ocasión queremos producir tres ARNs constituyentes de un complejo de ribonucleoproteína llamado partícula vault (el nombre vault viene de su forma, que recuerda a las bóvedas de las catedrales góticas). Expresar y acumular proteínas de interés en cultivos celulares puede ser relativamente fácil pero no lo es tanto cuando se trata de ARN, pues es una molécula muy inestable. Nuestro sistema aprovecha la estabilidad intrínseca del viroide para producir la molécula de interés, es decir, nuestra intención es usarlo como una especie de andamio.

insercion en plasmido6
Representación esquemática del proceso de inserción de un fragmento de ADN que codifica un ARN de interés en un plásmido bacteriano que expresa un viroide.

¿Cómo conseguimos este propósito? En primer lugar necesitamos una fábrica que nos proporcione la maquinaria requerida: usaremos células bacterianas de la especie Escherichia coli. En segundo lugar, necesitamos el libro de instrucciones que dirija la síntesis del viroide: usaremos un plásmido (pequeña molécula de ADN circular) que contenga dicha información. A continuación necesitamos insertar las secuencias de los ARN vault en el punto adecuado del plásmido del viroide (vamos, como encajar las piezas de un puzzle). Las tijeras que usamos para abrir el plásmido y recortar los extremos del inserto se llaman enzimas de restricción. Finalmente necesitamos introducir los plásmidos resultantes dentro de las células bacterianas. Esto último se consigue mediante un proceso llamado electroporación el cual consiste en aplicar un pulso eléctrico a las células para abrir poros que permitan la entrada. Cabe añadir que para conseguir circularizar el ARN viroidal necesitamos expresar al mismo tiempo una tRNA ligasa, simplemente adjuntando otro plásmido que codifica para dicha enzima.

Nuestros resultados muestran, de momento, una producción aceptable de las moléculas quiméricas. Ahora estamos trabajando en el siguiente paso: encontrar la forma de liberar los ARNs vault del esqueleto del viroide.

Post escrito por Inma Monzó Donat.

12 comentarios

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Antonio Antonio

Muy interesante la investigación. ¿Cómo sabéis que el ARN obtenido será estable en el citoplasma? ¿Por ensayo y error? ¿O usáis programas informáticos para simularlo?

Inma Inma

Hola Antonio, disculpa la espera. Como todos en este oficio, nos basamos en estudios experimentales para corroborar nuestras hipótesis. Las plantas poseen un sistema de defensa frente a patógenos y los viroides han sido capaces de resistir y continuar siendo infectivos. Lo más probable es que haya podido ser porque son moléculas circulares altamente estructuradas. Entonces, en este caso, aunque queremos producirlo en un sistema heterólogo (las bacterias) partimos de la misma premisa y veremos si se cumple o no. Te puedo decir que se acumula viroide y además, mejor si hay una tRNA ligasa en el sistema (la cual se encarga de circularizar la forma lineal del viroide conforme ésta va siendo producida).

Antonio Antonio

Hola, Inma:

Mi pregunta no iba por ahí, sino por lo siguiente:

Por lo que he podido entender, queréis producir en masa varios ARNs o proteínas usando viroides, y la unión de estos ARNs con viroides no siempre es estable en el citoplasma, algunos van bien y otros no. Mi pregunta era si simplemente probáis a unir el ARN con el viroide (que, según parece, es un proceso complicado y que lleva su tiempo) y miráis qué tal va en las células, o bien haceis una prueba previa mediante un programa de simulación química y sólo probáis en experimentos reales los ARNs más prometedores. Por lo que me cuentas, entiendo que es lo primero, ¿no?

Inma Inma

Hola Antonio,
Sí, sí, no te equivocas. No hemos usado ningún programa informático previamente a los experimentos. En verdad, tiene mucha lógica lo que dices de hacer un estudio a priori de la estructura de la molécula, lo cual podría ayudar a “no pisarse los dedos” pero aún así resulta difícil saber si esa estructura se acumulará o no. En este caso sólo queremos tres ARN, tampoco son tantos como para no arriesgarse.
¡Un cordial saludo!

Alvaro Farrar Alvaro Farrar

¿Como de pequeño es ese ARN circular del viroide? ¿De cuantos nucleótidos estamos hablando?

Inma Inma

Hola Álvaro, los viroides se caracterizan por tener un genoma pequeño, el rango general está de 246 a 401 nucleótidos. Este ELVd tiene 333 nucleótidos.

Inma Inma

¡Gracias por participar en los comentarios! ¡Cualquier inquietud que tengais, no dudeis en preguntar!

Seila Seila

Hola. He leído tu libro de Comer sin miedo y me ha encantado por toda la información que se desarrolla y con esa nota de ironía que no es típico de estos libros. Considero que se lo habría de leer casi todo el mundo.
Quería preguntarte que opinas sobre los suplementos para fortalecer el cabello en una época del año cuando hay más caída, yo me los tomo y me van bien. Querría saber si están a la altura de complementos vitamínicos que ya mencionas en tu libro. Junto con éstos también a veces tomo de la misma marca Inneov de farmacia para proteger del sol.
Gracias

J. M. Mulet J. M. Mulet

Gracias seila, me alegro que te haya gustado, por lo demás. He mirado por encima el suplemento que me comentas. para evitar la caída del cabello solo conozco el minoxidil y no hace milagros. He visto también que en el que protege del sol uno de los ingredientes es licopeno, que es uno de los antioxidantes que contiene el tomate. Haz números. Seguro que en un tomate tienes más licopeno y más barato. Sobre lo del probiótico y el sol, no me suena nada, pero hablan de un estudio que no citan.

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